細胞中的痕量元素分析對于研究細胞信號傳導、生理病理學和疾病的早期診斷至關重要。電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）是痕量元素分析的有力工具之一，具有高靈敏度和多元素/同位素同時檢測的優(yōu)點。然而，將ICP-MS直接用于細胞中的痕量元素分析時，通常會面臨細胞消耗量較大（通常為104-106個細胞）、基質(zhì)干擾和細胞內(nèi)目標元素含量低于儀器檢出限等問題。在引入ICP-MS之前，采用微型化的樣品前處理手段，可以在一定程度上去除復雜基質(zhì)、富集胞內(nèi)目標元素。微流控芯片具有多功能集成、適合微量樣品處理的特點，在芯片上集成樣品引入單元和前處理模塊可以大大提高分析效率。

近期，武漢大學胡斌教授課題組報道了一種采用3D打印技術構建的集細胞裂解、整體柱微萃取、微閥控制單元和微流全耗型高效霧化器多功能一體化的微流控芯片，并將其用于細胞中痕量稀土的分析，相關成果以“3D Printed All-in-One Sample Introduction System for ICP-MS: Integrating Chip-Based Array Monolithic Microextraction, Microvalve Control, and Microflow Nebulizer"為題發(fā)表在國際雜志《Analytical Chemistry》上。

研究團隊采用摩方精密面投影微立體光刻（PμSL）3D打印技術制造的一體化樣品引入系統(tǒng)主要包含多功能陣列整體柱微萃取芯片和可拆卸微流全耗型高效霧化器（MTHEN）。該3D打印（3DP）陣列整體微萃取芯片由細胞裂解單元和陣列整體微萃取單元組成，并集成了微閥控制單元以實現(xiàn)上樣/解吸的自動切換，通過具有定制結構和接口的3DP-MTHEN將其與ICP-MS在線連接。結合ICP-MS檢測，系統(tǒng)評估了3DP整體柱對痕量稀土元素(REEs)的萃取性能以及3DP-MTHEN的霧化性能，并將其用于少量MCF-7細胞中痕量REEs的分析。

由摩方精密microArch® S130 （精度：2 μm）3D打印系統(tǒng)制備的3DP陣列整體柱微萃取芯片包括兩個并聯(lián)的微萃取單元，通過微閥控制單元集成在一起；每個微萃取單元設計了三個入口（圖1A），分別用于將細胞溶液、裂解液和解吸溶液引入芯片。芯片入口設計為與商品化軟管（外徑1.5 mm）相匹配的長3 mm、內(nèi)徑1.5 mm、外徑4 mm的管狀結構，直接與商品化軟管相契合。裂解單元由5個內(nèi)徑為150 μm、長軸為4 mm、短軸為1.5 mm的橢圓形通道組成（圖1B），液體在橢圓中間裂分為兩股，在流過半個橢圓通道后交匯，從而加快液體混合。微萃取單元的微觀結構模擬金屬有機框架UiO-66的骨架，其中拓撲重復單元的結構為：直徑20 μm、底部方形邊長80 μm，由這些拓撲重復單元組成了長度為1.2 cm、內(nèi)部為0.75 mm × 0.75 mm × 12 mm的方形整體柱（圖1C）。設計并構建了微閥控制單元實現(xiàn)流體控制：通過在溶液通道周圍設計三個氣體通道，氣體流向垂直于液體流向，通過通/不通氣體控制溶液的阻斷和流通（圖1D）。在一個3DP陣列整體柱微萃取芯片中，并行制造了兩個微閥，分別用于控制廢液和解吸液的流出。在出口單元中，將兩路解吸液合并為一路與3DP-MTHEN相連，與后續(xù)ICP-MS檢測實現(xiàn)在線聯(lián)用（圖1E）。

根據(jù)N,N-雙（羧甲基）-L-賴氨酸（NTA）與REEs之間的強絡合能力（logβ1=10-12.5），將其用于3DP整體柱骨架的表面氨羧官能團改性（圖1F）。目標REEs在未改性3DP整體柱上的吸附效率小于50%。隨著改性次數(shù)的增加，目標REEs的吸附效率逐漸增加。經(jīng)過4次改性后，3DP整體柱對REEs的吸附效率達到95%以上（圖2）。

改性前后芯片整體柱橫截面的表面形貌如圖3所示：該3DP芯片整體柱結構均勻，與設計的模型結構一致。改性后的芯片整體柱上可以觀察到明顯的涂層結構，說明聚多巴胺介導的功能化涂層在芯片整體柱表面的成功制備。利用壓汞法考察了NTA改性的3DP芯片整體柱的孔徑分布（圖3E）：該芯片整體柱的孔徑主要分布在20-60 μm處，與模型設計的拓撲孔結構尺寸吻合良好。利用XPS對NTA改性前后的芯片整體柱表面進行表征，結果顯示：改性后的芯片整體柱在402 eV處出現(xiàn)了新的特征峰，對應為NTA上叔胺的特征峰，說明芯片整體柱表面NTA的成功改性（圖3F）。

3DP-MTHEN的設計和實物照片分別如圖4A和4B所示，MTHEN的長度及碗狀接口的設計是為了匹配本研究所使用的ICP-MS儀器的炬管。為了在霧化過程中保持穩(wěn)定，在圓柱形MTHEN中設計了一個中心有圓形通道的三棱柱結構。使用商品化毛細管作為MTHEN中用于液體引入的內(nèi)管，通過將圓形通道的內(nèi)徑設計為內(nèi)管的外徑來固定內(nèi)管的位置。將ICP載氣均分為三路，分別從三棱柱與進樣管空隙處引入，在MTHEN的尖部噴嘴處形成高壓，將內(nèi)管引入的液體霧化成氣溶膠。

以Li、Co、In和U為代表元素，以靈敏度和穩(wěn)定性為評價指標，優(yōu)化了影響3DP-MTHEN分析性能的諸多因素。在0.96-1.12 L min-1的流速范圍內(nèi)，隨著載氣流速的增大，Li、In、Co和U的信號強度均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當流速低于1.10 L min-1 時，其信號強度的相對標準偏差（RSD）沒有明顯變化；隨著載氣流速繼續(xù)增大，其RSD逐漸增大。在本研究中，選擇載氣流速為1.04 L min-1，此時信號靈敏度最高，穩(wěn)定性較好（RSD<10%）。在1-8 μL min-1的范圍內(nèi)，考察了樣品流速對Li、Co、In和U的信號強度和穩(wěn)定性的影響，隨著樣品流速的增大，四種元素的信號強度逐漸增大；當流速大于6 μL min-1時，其信號強度達到平臺；當流速達到8 μL min-1時，在炬管壁上觀察到霧滴，說明此時霧化器產(chǎn)生的氣溶膠粒徑較大，未被全部引入ICP中。在1-7 μL min-1的流速范圍內(nèi)，RSD均小于10%，說明霧化效果較為穩(wěn)定。在本研究中，選擇樣品流速為6 μL min-1。

利用噴霧激光粒度分布儀對距離霧化器噴嘴平面15 mm處的氣溶膠粒徑分布進行了考察，結果如圖5所示。可以看出，3DP-MTHEN產(chǎn)生的氣溶膠Sauter平均粒徑D3,2（定義為氣溶膠體積-表面積比）為5.4 μm，粒徑小于8 μm的氣溶膠個數(shù)占氣溶膠總個數(shù)的82.0%。通過計算得到3DP-MTHEN的霧化效率和傳輸效率分別100%和81.1%，傳輸效率與霧化器產(chǎn)生的粒徑小于8 μm的氣溶膠個數(shù)占氣溶膠總個數(shù)的百分比（82.0%）吻合良好。

圖6為用于ICP-MS的3DP一體化樣品引入系統(tǒng)的照片，其中3DP陣列整體柱微萃取芯片通過3DP-MTHEN與ICP-MS在線聯(lián)用，用于MCF-7細胞中超痕量REEs的測定。所建立的分析方法操作簡單，細胞消耗量少（500個細胞），方法的精密度和檢出限分別為2.2-11.9%和1.3-8.6 ng L-1，可實現(xiàn)細胞基質(zhì)中超痕量REEs的定量。

總結：

本研究通過3DP技術構建了由陣列整體柱微萃取芯片、微閥和微流霧化器組成的多功能一體化樣品引入系統(tǒng)，將其與ICP-MS在線聯(lián)用，用于細胞中超痕量REEs的分析。多功能陣列整體柱微萃取芯片集成了細胞裂解單元、整體柱微萃取和微閥控制單元，具有結構簡單、使用壽命長、死體積小、成本低、易于與ICP-MS檢測相匹配等優(yōu)點。將高度集成的3DP一體化樣品引入系統(tǒng)作為ICP-MS的樣品引入單元，基于此所構建的在線分析方法細胞消耗量低，適用于分析小體積復雜樣品，為后續(xù)REEs的細胞毒性研究提供了有力的技術支持。